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视网膜母细胞瘤病人体细胞中RB1基因突变的检测

来源:天下论文    时间:2014-03-28 15:22  浏览次数:

  视网膜母细胞瘤病人体细胞中RB1基因突变的检测

  作者:盛迅伦,吴伟民,庄文娟,容维宁,王娟,夏美华,章玲

  【摘要】 目的 检测视网膜母细胞瘤(RB)病人体细胞中RB1基因突变,探讨RB1基因突变的分子生物学机制。方法 应用PCR-SSCP技术筛查RB病人白细胞基因组DNA,测序分析确定突变。结果 在12例RB病人中,确定3例RB1基因生殖细胞性突变。他们分别是第10外显子中T至A杂合性突变, 将苯丙氨酸编码序列变为酪氨酸编码序列;第10外显子1bp碱基缺失 (GAT→AT), 发生阅读框架改变;第22外显子中 A至T杂合性突变, 将精氨酸序列变为终止密码。结论 这3例RB1基因生殖细胞性突变的方式为点突变和小缺失,这些突变改变了RB1基因的遗传信息,致使异常的RB1基因蛋白产生,导致视网膜母细胞瘤的发生。

  【关键词】 视网膜母细胞瘤 基因 突变 RB1

  视网膜母细胞瘤(简称RB),是婴幼儿最多见的高度恶性、致死率高的眼内恶性肿瘤。由视网膜母细胞瘤基因(RB1基因)的两条等位基因同时失活所致,分遗传型(30%~40%)和非遗传型(60%~70%)两种方式。遗传型视网膜母细胞瘤病人体细胞都携带RB1基因生殖细胞性突变,85%~90%可能会发生双眼或单眼多灶型视网膜母细胞瘤,下一代子女中约有50%的机会遗传这一突变的基因,而其中的90%会患视网膜母细胞瘤。因而,基于RB1基因生殖细胞性突变检测(遗传分型、产前与症状前基因诊断),目前是视网膜母细胞瘤的预防与早期诊断的有效途径。为了进一步了解RB病人RB1基因的突变特点,为临床遗传检查提供更多可靠的信息,笔者应用分子生物学技术对RB病人体细胞中RB1基因进行突变位点的检测,并结合以前的工作,探讨了RB1基因突变的分子生物学机制。

  1 资料与方法

  1.1 一般资料 共收集散发RB病人12例,4例为双眼RB,其他8例为单眼RB,年龄1~5岁;同时收集了12例无亲属关系的健康人作为正常对照组。

  1.2 方法

  1.2.1 DNA提取 采外周静脉血10ml,应用DNA分离试剂盒(Promega公司产品)提取全血白细胞DNA。

  1.2.2 聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR) 应用美国PE 公司2400型PCR仪。参照Toguchida报道的方法进行PCR引物设计。PCR反应体系:10×Buffer 2μl(含MgCl2 10 mmol/L),2×dNTP 2μl (2mmol/L)引物2μl(10mmol/L),DNA模板1μl (1mmol/L),Taq plus I DNA聚合酶0.5μl(510u/L),加双蒸水至100μl。95℃变性1min进入循环。95℃ 30s,退火30s,退火温度50℃~70℃(不同外显子,不同温度)。72℃延伸30s,共30个循环。最后72℃ 再延伸7min。PCR扩增产物的分析:取扩增产物5μl在1.5%琼脂糖凝胶电泳后进行EB染色,同时加Marker标记DNA相对分子质量。透射紫外线观察DNA电泳带,照相。

  1.2.3 单链构象多态性(single strand conformation polymorphism,SSCP) 分析 将PCR产物置95℃下变性10min,加入10%非丙烯酰胺电泳槽孔中,50℃,2h,电压200~400V,银染、显带、干燥。

  1.2.4 DNA测序 通过SSCP分析如发现有变异带出现,则将该PCR产物利用双脱氧末端终止法进行直接测序。

  2 结果

  通过PCR-SSCP分析,在12例病人中发现3例SSCP电泳有变异DNA单链带(图1~3)。其中2例经临床及病理检查确诊为双眼 RB,1例为单眼RB。这3例病人均无家族史。PCR产物克隆测序分析显示:例1(3号)双眼RB病人10号外显子5’端至3’端第22bp处发生 T→A置换,由TTC变为TAC,将苯丙氨酸编码序列变为酪氨酸编码序列(图1);例2(7号)双眼RB病人10号外显子5’端至3’端第64bp处发生 1bp碱基缺失(GAT→AT) (图2),发生阅读框架改变;例3(14号)22号外显子5’端至3’端第36bp处发生 A→T置换,由AGA变为TGA,将精氨酸序列变为终止密码(图3)。

  3 讨论

  RB1基因(视网膜母细胞瘤易患基因)位于人类13号染色体长臂1区4带,有27个外显子,分布范围180kb,转录一4.7kbmRNA,其蛋白产物为一115kb核内磷酸蛋白。各种原因致使RB1基因失活是视网膜母细胞瘤发生的直接原因。

  RB分遗传性和非遗传性两种。遗传性和非遗传性病例发病特征的差别可以用Knudson的二次突变学说解释。Knudson于1971年提出的二次突变学说认为RB发生要经历两次突变。遗传性第一次突变是生殖细胞突变,由此发育而来的子代所有体细胞均带有一次突变,表现肿瘤易感性。视网膜任何一个细胞只需发生一次突变即可发生RB,而其他部位体细胞也只需一次突变即可发生恶性肿瘤,故RB发生早,多中心,发生第二肿瘤危险性高,且可遗传。这种生殖细胞突变可以来自病人父母的遗传(有家族史),但以胚胎发育早期的生殖细胞新发生的突变更多见(无家族史),非遗传型RB病人中,生殖细胞遗传了正常的两个RB基因,两次突变需发生于同一视网膜细胞才可能发病。因为同一细胞连续发生两次突变可能性非常小、故这些病例总是单侧单中心性发生,且发病晚。而所有体细胞遗传了正常的RB基因。所以发生二次恶性肿瘤的危险性与正常人相同。

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