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乳腺癌端粒酶活性与PCNA表达关系

来源:论文天下    时间:2013-12-25 10:56  浏览次数:

 

  乳腺癌端粒酶活性与PCNA表达关系

  作者:张斯,于秀婷,孟凡,

  【关键词】 乳腺癌;端粒酶;增殖细胞核抗原;多聚酶链式反应;免疫组织化学

  摘要: 目的 探讨端粒酶活性与增殖细胞核抗原(PCNA)表达之间的关系及联合检测对乳腺癌术后治疗方案制定和预测预后的意义。方法 采用端粒重复序列扩增聚合酶链反应-酶联免疫吸附测定法(TRAP-PCR-ELISA)和免疫组织化学链霉素生物蛋白过氧化物酶(S-P)法对80例乳腺癌组织、36例乳腺癌相应癌旁组织和10例乳腺良性病变的端粒酶活性及增殖细胞核抗原进行检测。结果 (1)80例乳腺癌患者癌组织标本、36例乳腺癌相应癌旁组织标本中端粒酶表达阳性率分别为650%和83%,差异有统计学意义(P<001);10例乳腺良性病变组织标本中未检测出端粒酶活性;腋窝淋巴结有无转移与端粒酶阳性表达率差异无统计学意义(P>005)。(2)80例乳腺癌组织中PCNA的阳性表达率为6375%;乳腺癌有淋巴结转移组PCNA阳性表达率显著高于无淋巴结转移组(P<001),且呈正相关(P<001),即淋巴结转移程度越低,PCNA阳性表达率亦越低。(3)端粒酶活性与PCNA表达具有一致性(P<001),且呈正相关(P<001),一致率为8625%。结论 端粒酶活性与PCNA表达具有一致性,端粒酶活性与PCNA联合检测,可为乳腺癌术后治疗方案的制定和预测预后提供辅助依据。

  关键词: 乳腺癌;端粒酶;增殖细胞核抗原;多聚酶链式反应;免疫组织化学

  增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)是一种表达细胞增殖周期的36kd多肽,直接参与细胞增殖过程中DNA的复制,其表达程度能客观反映肿瘤细胞的增殖活性,过度表达增加了瘤细胞转移趋势的危险性,PCNA可作为判断肿瘤预后的指标〔1〕。为探索乳腺癌组织端粒酶活性与增殖细胞核抗原表达的关系,对80例乳腺癌组织、36例乳腺癌相应癌旁组织和10例乳腺良性病变的端粒酶活性及增殖细胞核抗原进行检测。

  1 对象与方法

  11 对象 收集我院1992~2002年女性乳腺癌根治标本病理检查存档资料80例,乳腺癌相应癌旁组织(距离肿瘤2cm以上)36例,年龄32~72岁,平均年龄4846岁;乳腺良性病变10例,平均年龄3850岁。全部资料经2位病理医师审核,患者术前未做过放、化疗。乳腺癌分类根据“中国常见恶性肿瘤诊治规范”分为非浸润性癌、早期浸润性癌、浸润性特殊癌、浸润性非特殊癌4类。

  12 试剂与仪器 端粒多聚酶链反应-酶联免疫吸附(Telomerase PCR ELISA)试剂盒(德国Boehringer Mannhein公司);阳性对照为肿瘤293细胞株(检测试剂盒提供);阴性对照为不含蛋白的裂解液;Ⅰ抗PCNApc10和链霉素生物蛋白过氧化物酶(S-P)试剂盒及过氧化物酶底物作用液二氨基联苯氨(Diaminobenzidine,DAB)(北京中山生物技术有限公司);用已知乳腺癌组织阳性切片(北京中山生物技术有限公司)为阳性对照,用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)代替Ⅰ抗做阴性对照。酶标仪(SPECTRAⅢ)(美国Dynex公司)PCR(T-1 thermoblock)(德国Biometra公司)。

  13 端粒酶活性检测 (1)端粒酶提取:每份标本用病理切片机切10~15μm厚50片,加入预冷的端粒酶裂解液20μl,放置冰上裂解30min,1600r/min 4℃离心20min,取175μl上清液为提取液,放置于-80℃冰箱中保存备用。(2)端粒酶活性检测:端粒重复序列扩增-多聚酶链反应-酶联免疫吸附(TRAP-PCR-ELISA)法〔2,3〕,取细胞提取液1~2μl加入25μl端粒重复序列扩增-多聚酶链反应(TRAP PCR)扩增液;无菌二乙基焦碳酸酯(diethyprocarbonate,DEPC)水补足至体积50μl混匀;在PCR扩增仪上按以下步骤进行引物的延伸及扩增反应:95℃ 5min预变性,再以94℃ 30s变性、50℃ 30s退火、72℃ 90s延伸,共循环30个周期,最后72℃延伸10min。取上述PCR产物5μl加变性试剂20μl混匀,置室温10min;加入杂交液225μl混匀后取出100μl移至包被于抗地高辛的酶标板中室温作用2h;加入抗地高辛过氧化物酶并与底物作用30min后终止反应。用酶标仪测其在波长450nm的吸光度(A)值。

  14 PCNA检测 采用免疫组织化学S-P法染色,按试剂盒说明书操作:所有标本均经10%福尔马林固定,石蜡包埋,4μm连续切片。二甲苯脱蜡,梯度酒精至水化后高压锅热处理5~8min,过氧化物酶阻断血清封闭,加Ⅰ抗60min,PBS液洗3次,每次2min;Ⅱ抗15min,PBS液洗3次。每次2min;Ⅲ抗同Ⅱ抗。DAB显色5~10min,苏木素复染5~10s,脱水,透明胶封片。

  15 结果判断 端粒酶以吸收度(A)>020为阳性判断标准。PCNA以细胞核内出现清晰的棕色或棕黄色颗粒为阳性诊断标准,每例切片至少观察5个高倍视野。

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