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维A酸对人类恶性黑色素瘤A375细胞增殖的影响

来源:论文天下    时间:2013-11-19 16:07  浏览次数:
  维A酸对人类恶性黑色素瘤A375细胞增殖的影响
  作者:牛新武,冯捷,彭振辉,马惠群,刘超,张宪旗
  【摘要】 目的: 研究维A酸(RA)抑制人类恶性黑色素瘤A375细胞增殖的作用. 方法: 用RA(atRA, 13cisRA和9cisRA)、MA(RXR激动剂)及TTNPB(RAR激动剂)处理培养的人类恶性黑色素瘤A375细胞. 用MTT法研究这些试剂对细胞增殖的影响,用流式细胞仪研究这些试剂对细胞周期的影响. 结果: RA和TTNPB均可抑制A375细胞的增殖,而MA无此作用. 在作用24 h时的不同浓度(10-5, 10-6和10-7 mol/L)以及作用48和72 h的10-5 mol/L浓度时,TTNPB的抑制增殖作用均强于其它试剂处理组(P<0.05). 细胞周期分析结果显示RA和TTNPB均可诱导A375细胞G0/G1期阻滞,而MA无此作用. 在作用24和48 h时的10-5 mol/L浓度时,TTNPB的诱导G0/G1期阻滞作用均强于其它试剂处理组(P<0.05). 结论: RA可抑制人类恶性黑色素瘤A375细胞的增殖,并诱导G0/G1期阻滞. RA的这些作用与RXR的激活无关,而可能与RAR的激活有关.
  【关键词】 维生素A酸类;黑色素瘤;A375细胞;细胞分裂
  0引言
  恶性黑色素瘤是常见的皮肤恶性肿瘤,近年来发生率有增长趋势,但至今尚无有效的治疗方法. 维A酸(RA)能够抑制多种恶性肿瘤细胞株的生长,并且可诱导其向正常细胞分化. RA在体内主要是通过RA受体(RAR)和RA X受体(RXR)发挥多种生理或药理学作用的. 然而,RA抑制肿瘤细胞增殖的作用与RAR和RXR的关系至今尚不清楚. 本实验中,我们研究了3种RA和2种RA受体激动剂对人类恶性黑色素瘤A375细胞株的抑制作用.
  1材料和方法
  1.1材料
  人类恶性黑色素瘤A375细胞株(西安交通大学第二医院皮肤科冉立伟博士惠赠). 全反式RA(atRA)、13顺RA(13cisRA)、9顺RA(9cisRA)、Methoprene acid(MA, RXR激动剂)、TTNPB (RAR激动剂)、二甲基亚砜(DMSO)购于美国Sigma公司. 所有RA以10-2mol/L浓度溶于DMSO,-70℃避光保存. MTT购于中山公司. 细胞培养所需的主要试剂为Gibco产品. 高通道多功能微板测试系统(德国BMG公司). FACSCalibur型流式细胞仪(美国BD公司).
  1.2方法
  人类恶性黑色素瘤A375细胞于含100 mL/L胎牛血清RPMI 1640(含1×106 u/L青霉素和1×106 u/L 链霉素)中培养. 在37℃, 50 mL/L CO2条件下进行细胞培养. 当细胞生长达到70%~80%融合时,胰酶消化并传代细胞. 将处于对数生长期的细胞接种于96孔培养板,于细胞培养箱中孵育4 h后取出,加入各种试剂及100 mL/L FBS RPMI 1640. 每孔液体总量最终为200 μL,试剂终浓度为1×10-5, 1×10-6或1×10-7 mol/L. 每孔细胞数为1×104个. 设对照组(只加细胞不加试剂)和空白对照组(只加100 mL/L FBS RPMI 1640). 每组设3个平行孔. 将培养板移入细胞培养箱孵育24, 48 或72 h. 取出培养板,每孔中加入MTT 20 μL后再次孵育4 h,弃上清液后每孔加入DMSO 150 μL. 高通道多功能微板测试系统中振荡5 min后在570 nm波长处检测A值. 重复实验3次. 另将细胞种于6孔培养板,于细胞培养箱中孵育4 h后取出,避光加入各种试剂及100 mL/L FBS RPMI 1640. 每孔液体总量为4 mL,试剂终浓度为1×10-5 mol/L,每孔细胞数为2×105个. 每次实验设1个对照组(只加细胞不加试剂). 每组设2个平行孔. 再次将培养板移入细胞培养箱孵育,于24, 48 或72 h时收获细胞. -20℃ 750 mL/L乙醇固定4℃过夜. PI染色缓冲液(50 g/L PI
  和15 g/L Rnase) 避光室温孵育20 min,用流式细胞仪进行细胞周期分析. 重复实验3次.
  统计学处理: 用SPSS 10.0统计学软件进行方差分析,结果以x±s 表示,P<0.05为差异有统计学意义.
  2结果
  2.1细胞增殖MA无抑制A375细胞增殖的作用,而TTNPB在作用24和48 h时有抑制A375细胞增殖的作用,作用72 h时的高浓度时,也可抑制A375细胞增殖. 所有RA均有抑制A375细胞增殖的作用,但作用强度不同,atRA和13cisRA作用24和48 h有抑制A375细胞增殖的作用,但9cisRA仅在作用24 h的10-5 mol/L和10-6 mol/L浓度条件下有抑制A375细胞增殖的作用,并且其抑制作用弱于atRA和13cisRA处理组(P<0.05, Tab 1). 表1各种RA对A375细胞的抑制作用(略)
  2.2对细胞周期的影响MA不增加A375细胞G1/G0期细胞百分率,而TTNPB作用24和48 h时可增加G1/G0期细胞百分率. 3种RA在作用24 h时均可增加G1/G0期细胞百分率,作用48 h时9cisRA已经无此作用. 作用72 h所有试剂对G1/G0期细胞百分率均无明显的影响(Tab 2). 表2各种RA对A375细胞G1/G0期百分比的影响(略)
  3讨论
  RA是维生素A的代谢物或衍生物,对多种肿瘤细胞株有抑制增殖的作用,其中包括恶性黑色素瘤细胞株,但RAR及RXR在其中所起的作用尚不清楚. 本研究发现,3种RA和RAR激动剂TTNPB均可抑制人类恶性黑色素瘤A375细胞的增殖,其中以TTNPB的抑制作用最强,而RXR激动剂MA则无此作用,说明RA具有抑制A375细胞增殖的作用,RXR的激活与RA抑制A375细胞增殖无关,而RAR的激活则可能与RA抑制A375细胞增殖有关. 细胞周期分析显示,RA和TTNPB具有诱导A375细胞G0/G1期阻滞的作用,其中以TTNPB的抑制作用最强,而MA无此作用,从而说明RXR的激活与RA诱导A375细胞G0/G1期阻滞无关,而RAR的激活则可能与这种作用有关. 实验结果显示,3种RA虽然都可抑制A375细胞增殖及诱导G0/G1期阻滞,但作用强度不同,以9cisRA的作用最弱. 这3种RA有着不同的受体结合特点,atRA是RAR和RXR的结合配体,13cisRA是RAR配体,9cisRA是RXR的配体,但它们为同型异构体,在细胞内可发生相互转换,所以尽管atRA和13cisRA为RAR的配体,但它们抑制A375细胞增殖和诱导G0/G1期阻滞的作用弱于 TTNPB. 同样,尽管9cisRA为RXR的配体,但可通过互变异构活化RAR,从而具备一定的抑制A375细胞增殖和诱导G0/G1期阻滞作用.

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