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染料木黄酮与顺铂联用对耐药卵巢癌细胞SKOV

来源:天下论文    时间:2014-02-26 16:07  浏览次数:

  染料木黄酮与顺铂联用对耐药卵巢癌细胞SKOV

  作者:袁鹏,黄艳红,辛晓燕,宋晖,田爽,王德堂

  【摘要】 目的:探讨染料木黄酮与顺铂联用对耐药卵巢癌细胞系SKOV3增殖与凋亡的影响. 方法:采用MTT比色法检测染料木黄酮和顺铂联用对SKOV3细胞增殖的影响,Hoechst染色荧光显微镜下观察联合用药后细胞形态的改变,流式细胞仪分析细胞周期并检测凋亡率. 结果:联用不同浓度的染料木黄酮后顺铂对SKOV3细胞IC50降低率为32.3%~79.8%,两药联合作用系数在0.586~0.869之间,为轻度至高度协同作用. 染料木黄酮与顺铂联用可显著提高凋亡率,两药联用诱导SKOV3细胞凋亡和阻滞G2/M期、干扰S期进程,凋亡率与G1期细胞比例呈负相关(rs=-0.953, P<0.05). 结论: 染料木黄酮可以增强顺铂对SKOV3细胞的增殖抑制作用和杀伤作用,两种药物具有协同作用. 染料木黄酮阻滞细胞于G2/M期并同时干扰S期进程可能是两药发挥协同作用的重要机制.

  【关键词】 染料木黄酮;顺铂;卵巢肿瘤;药物协同作用

  0引言

  近年来染料木黄酮(4,5,7三羟基异黄酮,genistein)对肿瘤生长的抑制作用日益受到重视,尤其是它可以增强常规化疗药物的疗效[1-2]. 而染料木黄酮和传统化疗药物顺铂联用能否增强顺铂对耐药卵巢癌的杀伤作用呢?为此,我们研究了染料木黄酮与顺铂联用对耐药卵巢癌SKOV3细胞增殖与凋亡的影响及其机制.

  1材料和方法

  1.1材料

  人卵巢浆液性乳头状囊腺癌细胞系SKOV3由西京医院妇产科实验室保存,该细胞系对顺铂等多种药物耐药;RPMI 1640培养基(Gibco公司);新生牛血清(四季青公司);顺铂(齐鲁制药厂);染料木黄酮、二甲基亚砜(DMSO),Hoechst33342(Sigma公司);四甲基偶氮唑蓝(MTT)(Amresco公司). 细胞周期检测试剂盒为DNAPrep Stain kit(BeckmanCoulter公司);Wellscan MK3型全自动酶标仪(Labsystems Dragon公司);ELITE ESP型流式细胞仪(BeckmanCoulter公司).

  1.2方法

  1.2.1MTT法检测细胞增殖抑制率取对数生长期的SKOV3细胞,8×103个/孔接种于96孔培养板,置37℃,50 mL/L CO2培养箱培养12 h,细胞贴壁后弃去培养液,然后加入含不同浓度药物的培养基200 μL:对照组只加RPMI 1640培养基(100 mL/L小牛血清);顺铂组加入顺铂浓度分别为0.625,1.25,2.5,5,10,20 mg/L的培养基;染料木黄酮组加入染料木黄酮浓度分别为2.5,5,10,20,30,40,50 mg/L的培养基;染料木黄酮和顺铂联用组为2.5,5,10,20 mg/L的染料木黄酮与顺铂联用,顺铂浓度同单药组,每组均设6个复孔. 继续培养至加药后96 h,每孔加入MTT(5 g/L,20 μL),继续孵育4 h后弃培养液,每孔加入DMSO 150 μL,振荡10 min,用酶标仪检测各孔吸光值(A490 nm),按以下公式计算:细胞增殖抑制率=(对照组A490 nm-实验组A490 nm)/对照组A490 nm×100%,取6复孔均值绘制抑制率与药物剂量关系曲线,按作图法求出半数抑制浓度(IC50). 同时采用联合作用指数(combined index,CI)判断染料木黄酮和顺铂联用的性质. CI=DA/ICX,A+DB/ICX,B (A,B代表两种不同药物,ICX,A和ICX,B是两种药物单独使用使生长抑制率达X时的药物浓度,DA和DB是两药联用使生长抑制率达X时两种药物的浓度)[3]. 根据Soriano等[4]的判断方法,0.9≤CI≤1.1为叠加作用,0.8≤CI<0.9为低度协同作用,0.6≤CI<0.8为中度协同作用,0.4≤CI<0.6为高度协同作用,0.2≤CI<0.4为强协同作用.

  1.2.2荧光染色观察细胞形态的改变接种SKOV3细胞于盖玻片,置于六孔板内,细胞贴壁后加入不同药物,根据MTT结果分为4组:即对照,顺铂(2.5 mg/L),染料木黄酮(10 mg/L)和染料木黄酮(10 mg/L)+顺铂(2.5 mg/L). 继续培养36 h,固定后加入0.5 mL Hoechst33342(10 mg/L),染色15 min后弃染液清洗,抗荧光淬灭液封片,紫外光激发,在荧光显微镜下观察.

  1.2.3流式细胞仪检测细胞周期和凋亡的变化收集SKOV3细胞,调整细胞密度为5×107/L,以每瓶8 mL接种于75 mL培养瓶,细胞贴壁后弃去培养液,加入含不同浓度药物的培养基. 根据MTT结果,顺铂浓度选2.5 mg/L, 染料木黄酮浓度选5和10 mg/L,设对照、单药和联用共6组. 加药36 h后收集细胞,分别按DNAPrep Stain Kit试剂盒和Apoptosis Detection Kit试剂盒说明书进行细胞固定、染色,上流式细胞仪分析.

  统计学处理: SPSS 11.0软件进行秩相关分析.

  2结果

  2.1染料木黄酮与顺铂联用对SKOV3细胞增殖的影响染料木黄酮、顺铂单药的IC50分别为30.0 mg/L和9.9 mg/L,4种不同浓度的染料木黄酮与顺铂联用后顺铂的IC50明显降低,与单用顺铂组比较,4种不同浓度的染料木黄酮可使顺铂的IC50分别降低到 6.7,4.2,2.5和2.0 mg/L(图1). 当达到半数抑制时,不同浓度组合的染料木黄酮与顺铂的CI分别为0.760,0.591,0.586,0.869. 其中10和5 mg/L染料木黄酮与顺铂联用达到高度协同作用;20.0 mg/L和2.5 mg/L染料木黄酮与顺铂联用分别达到低、中度协同作用.

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