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卵巢癌组织KLK11基因的表达意义

来源:天下论文    时间:2014-02-24 16:05  浏览次数:

  卵巢癌组织KLK11基因的表达意义

  作者:王新艳,李玉华,朱韫春,张慧林,刘悦芳,唐奇

  【关键词】 卵巢癌;KLK11;RT

  【摘要】 目的: 探讨卵巢癌KLK11基因中的表达及临床意义. 方法: 采用RTPCR和免疫组化技术检测48例卵巢癌组织中KLK11 mRNA及其蛋白的表达,并分析其与临床病理资料的关系. 结果: KLK11蛋白表达位于细胞质. KLK11 mRNA及蛋白的表达与临床分期有关,晚期(Ⅲ, Ⅳ期)KLK11 mRNA及蛋白的表达水平明显高于早期(Ⅰ, Ⅱ期,P<0.05),中低分化癌KLK11 mRNA及蛋白的表达明显高于高分化癌(P<0.05),但KLK11 mRNA及蛋白的表达与组织学类型无关. 结论: KLK11基因表达可能与卵巢癌的恶性程度有关.

  【关键词】 卵巢癌;KLK11;RTRCR;免疫组织化学

  0引言

  卵巢癌死亡率占女性生殖系统恶性肿瘤的首位,至今发病机制尚未阐明,缺乏有效的早期诊断和治疗方法[1]. 人激肽释放酶基因家族Kallikrein(KLK)广泛存在于各种组织和体液中,编码相应的激肽释放酶HK, 参与多种生理和病理过程. Borqono等[2]发现70%的卵巢癌患者血清中HK11水平升高,提示KLK11在卵巢癌中可能存在异常表达. 我们采用逆转录―聚合酶链式反应(RTPCR)和免疫组化技术检测卵巢癌组织KLK11 mRNA及蛋白的表达,并结合临床病理特征进行分析,旨在探讨KLK11基因的表达与卵巢癌发病的关系,并初步探讨其发生机制.

  1材料和方法

  1.1材料  200411/ 200608首发卵巢癌手术新鲜标本48例,术前未经放化疗. 年龄35-75(平均55)岁. 切除卵巢均经患者同意. 按FIGO(1986年)修订的原发性卵巢恶性肿瘤的分期标准进行临床分期,Ⅰ期6例,Ⅱ期12例,Ⅲ期20例,Ⅳ期10例. 按WHO卵巢肿瘤组织学类型分类: 浆液性囊腺癌27例,粘液性囊腺癌13例,透明细胞癌5例,子宫内膜样腺癌3例. 按WHO分级标准并参照细胞分化程度分3 级:低分化10例,中分化22例,高分化16例. 新鲜肿瘤组织约2 cm×2 cm×1.5 cm立即放入液氮中速冻,转存于-70℃冰箱,用于提取mRNA. 其余部分用40 g/L中性甲醛固定,石蜡包埋,用于HE和免疫组化染色.

  1.2方法

  1.2.1RTPCR检测KLK11 mRNA采用RTPCR,用Trizol试剂(购自凯基生物公司)一步法提取细胞总mRNA,用AMV逆转录酶将其反转录成cDNA, βactin作为内参照基因. KLK基因和βactin均由上海英骏生化公司合成,KLK11基因引物正链:5′CCGCTACATAGTTCACCTGG3′,反链:5′ AGGTGTGAGGCAGGCGTAACT3′,扩增片断为296 bp. βactin cDNA特异性引物作为对照. PCR反应条件: 95℃变性4 min, 95℃变性30 s, 56℃退火30 s, 72℃延伸30 s,循环35次,最后72℃延伸5 min. PCR反应产物经过15 g/L琼脂糖凝胶电泳检测,凝胶成像仪观察拍照,应用Dolphin DUL软件分析癌灶及正常卵巢组织中KLK11 mRNA/βaction mRNA相对表达比.

  1.2.2免疫组化检测KLK11蛋白表达采用SABC法,SABC试剂盒购自迈新生物公司. 石蜡包埋切片,切片厚4 μm,脱蜡水化,阻断内源性过氧化物酶,微波修复抗原,羊血清封闭室温孵育,鼠抗人KLK11(mAb, 1∶600,购自Abcam公司),4℃过夜,滴加生物素标记的羊抗鼠IgG,室温下孵育,滴加SABC复合物,DAB/H2O2液显色,中性树胶封片. PBS代替一抗为阴性对照. KLK11阳性染色为棕黄色颗粒,采用德国Leica RX250型图像分析系统对免疫组化阳性染色进行定量分析,每张切片任选5个视野,测量每张切片阳性染色相对面积(阳性细胞面积/镜下细胞及间质总面积 ×100%)和阳性染色的灰度值.

  统计学分析: 应用SPSS11.0软件对KLK11基因表达情况进行统计学分析,不同临床病理分级及组织学类型间基因表达阳性率的比较用χ2检验进行,切片阳性染色积分灰度值组间比较用方差分析进行. P<0.05为差异有统计学意义.

  2结果

  2.1KLK11 mRNA表达KLK11 mRNA表达与卵巢癌临床病理特征关系密切(图1,表1). 随临床分期增加KLK11基因的mRNA表达水平增高,晚期卵巢癌(ⅢⅣ期)KLK11基因mRNA表达水平明显高于早期卵巢癌(ⅠⅡ期)(P<0.05);中低分化卵巢癌KLK11 mRNA表达明显高于高分化卵巢癌(P<0.05);KLK11 mRNA表达与卵巢癌组织学类型无关(P>0.05).

  2.2KLK11基因蛋白表达免疫组化阳性染色为棕黄色颗粒沉淀,位于癌细胞的细胞质(图2). KLK11蛋白在Ⅲ, Ⅳ期卵巢癌中阳性表达高于Ⅰ, Ⅱ期卵巢癌, 差异有统计学意义(P<0.05);在中低分化卵巢癌中阳性表达高于高分化卵巢癌,差异有统计学意义(P<0.05,表1);在浆液性囊腺癌、粘液性囊腺癌、子宫内膜样腺癌及透明细胞癌中阳性表达无明显差别(P>0.05).

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