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弥漫性大B细胞淋巴瘤bcl

来源:天下论文网    时间:2013-12-18 17:02  浏览次数:

  弥漫性大B细胞淋巴瘤bcl

  作者:蒋会勇,陈愉,张三泉,朱梅刚,赵彤

  【摘要】 目的: 探讨弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)bcl2/IgH基因重排与分子亚型生发中心样(GCB)的相关性. 方法:采用自行设计的半巢式PCR对60例DLBCL的bcl2/IgH基因重排进行了检测,并对阳性产物进行克隆、测序. 同时采用免疫组化SP法在组织微阵列上同步观测CD20,CD10,Bcl6,黑色素瘤相关抗原(突变体)1 (MUM1)的表达,进行GCB和非生发中心样(nonGCB)分子分类. 结果: 经常规法扩增bcl2/IgH,有6/60例DLBCL bcl2/IgH阳性;在6例阳性样本中,采用本组设计的半巢式PCR扩增,经克隆及测序证实5例bcl2/IgH基因重排阳性,1例为人类第19号染色体BAC 331191基因的片段. 60例DLBCL CD20表达全部阳性;CD10,Bcl6, MUM1的阳性表达率分别为43.3%,46.7%,61.7%;GCB 32(53.3%)例,nonGCB 28(46.7%)例. bcl2/IgH基因重排阳性的病例均属GCB分子亚型, 且与CD10表达有显著性相关(P=0.012),而与Bcl6及MUM1表达无相关性. 结论:使用本组设计的半巢式PCR可提高bcl2/IgH基因重排检测的准确性. bcl2/IgH基因重排的检测可协助确定部分GCB分子亚型的DLBCL.

  【关键词】 弥漫性大B细胞淋巴瘤; bcl2; 基因重排

  0引言

  弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large Bcell lymphoma, DLBCL)是最常见、高度恶性的非霍奇金淋巴瘤,但新近cDNA芯片的研究结果显示,该瘤存在生发中心样(germinal center Bcelllike,GCB)和非生发中心样(non germinal center Bcelllike, nonGCB)两种分子亚型,GCB的预后明显好于nonGCB类型[1-2]. Hans等[3]以cDNA芯片为参照标准,发现利用“套餐”式免疫标记物CD10,Bcl6,黑色素瘤相关抗原(突变体)1 [melanoma associated antigen(mutated)1, MUM1]也可以对DLBCL进行分子分类. bcl2/IgH基因重排是人类恶性淋巴瘤最常见的染色体异常,存在bcl2基因重排的病例有较好的生存率. 我们利用组织微阵列(tissue microarray, TMA)技术对60例DLBCL进行分子分类, 采用PCR技术检测bcl2/IgH基因重排,探究bcl2/IgH基因重排与分子亚型的相关性,旨在为临床判断DLBCL的预后提供更多的信息.

  1材料和方法

  1.1材料1999/2003年诊断明确资料齐全的DLBCL 60(男29,女31)例,中位年龄53.3(16~91)岁,所有标本均为40 g/L中性甲醛固定, 常规石蜡切片HE染色. 由3名专门从事淋巴瘤研究的医师按新的WHO分类方法进行诊断. SP试剂盒购自北京中山生物技术有限公司; CD20购于福州Maxim公司;CD10购于美国Zymed公司;Bcl6购于美国Neomarker公司; MUM1 mAb由意大利Perugia大学血液病研究所Dr. Falini馈赠.

  1.2方法

  1.2.1bcl2/IgH基因重排的检测DNA提取采用我室建立的石蜡切片刮片法,每例切片1张,厚3 μm,常规脱蜡、干燥. 用无菌刀片刮入Eppendorf管,加入50 μL消化液(10 mmol/L Tris.HCl, 1 mmol/L EDTA, 200 mL/L Tween 20),同时加入蛋白酶K(终浓度为200 mg/L),56℃水浴孵育过夜,充分消化后,98℃, 10 min灭活蛋白酶K,12 000 g离心10 min,分装上清液,用分光光度计检测DNA的浓度,将浓度调整至200~400 μg/L,-20℃保存备用.

  1.2.2半巢式PCR检测bcl2/IgH基因重排bcl2/IgH 基因重排的检测采用半巢式PCR. 第一次扩增PCR引物为:上游:MBR 5′TTAGAGAGTTGCTTTACGTGGCCTG3′; 下游JH1: 5′ACCTGAGGAGACGGTGACC3′. 该对引物为检测bcl2/IgH 基因重排常用引物[4]. 利用专业的引物设计软件Primer premier, 我们在MBR下游设计了第二重引物: Mbr1 5′CAACACAGACCCACCCAGAG3′与原下游引物JH1构成半巢式PCR反应的第二对引物. 反应体系为:10×PCR 缓冲液2 μL, 25 mmol/L MgCl2 1.5 μL, 10 mmol/L dNTP 0.4 μL,上下游引物各0.8 μL,Taq DNA聚合酶0.2 μL,模板1 μL(浓度200~500 mg/L),三蒸水13.3 μL,总反应体系为20 μL. 半巢式PCR的反应体系为10×PCR缓冲液2 μL, 25 mmol/L MgCl2 1.2 μL, 10 mmol/L dNTP 0.4 μL,上下游引物各1 μL, Taq DNA聚合酶0.25 μL,模板1 μL,三蒸水13.15 μL.反应条件为95℃变性5 min,94℃变性30 s,57℃退火45 s, 72℃延伸45 s, 共35个循环,然后,72℃终末延伸10 min,4℃保存30 min. 半巢式PCR模板为一步法的产物稀释100倍. 产物以20 g/L琼脂糖凝胶电泳, 溴化乙锭(EB)1.5 μL染色. 所有PCR操作过程中严格按PCR操作规程进行. 阳性对照采用经测序证实为基因重排阳性的DNA,阴性对照为双蒸水. PCR阳性产物经TA克隆连于T载体,送上海博亚公司进行测序. 测序采用3730测序仪,DNA测序技术主要依据Sanger双脱氧链终止法. 测序结果在基因库中进行比对,以明确是否为 bcl2/IgH 基因重排片段.

  1.2.3TMA制作首先对60例DLBCL蜡块组织的苏木精-伊红染色切片作形态学观察,选择有代表性的肿瘤区域,在相应位置进行标记;然后使用组织微阵列仪(Beecher Instruments, MTA1)制作受体蜡块并打孔,根据原有切片的标记部位,用供体针在蜡块相应部位取样,所用组织芯直径为0.6 mm,将供体组织芯放入受体蜡块. 每例标本在标记区域内随机取2~4条组织芯. 在组织样本填入蜡孔时记录每个样本在二维阵列中的具体位置,并在一定位置上标记出TMA的方位.

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