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口腔癌患者外周血树突状细胞的生物学特性

来源:论文天下    时间:2013-08-26 15:25  浏览次数:

  口腔癌患者外周血树突状细胞的生物学特性

  作者:张素欣,王士杰,单保恩,段玉芹,许艳枝

  【关键词】 口腔肿瘤;树突状细胞;表型;增殖

  【摘要】 目的: 研究口腔癌患者外周血树突状细胞(DC)的形态、表型和功能性变化及其临床意义. 方法: 口腔癌患者(实验组)及正常人(对照组)15例外周血单个核细胞经GMCSF,IL4及TNFα诱导培养, 获取成熟DC, 光镜和电镜观察细胞的形态,流式细胞仪检测细胞表型如CD1a,CD83,CD80,CD86和HLADR等分子的表达变化,用噻唑蓝(MTT)法检测DC与自体和同种异体的混合淋巴细胞反应(MLR)中对淋巴细胞增殖的刺激能力. 结果: 正常人及口腔癌患者的外周血单个核细胞经体外7 d诱导培养,均诱导出具有典型形态和表型的DC,其中实验组细胞的CD83,CD1a表达率分别为49.3±9.5和48.1±7.3,与对照组两者表达率62.1±7.9和60.2±6.8相比,差异有统计学意义(P<0.05),CD86,CD80和HLADR的表达率分别为85.5±8.7,83.2±8.1和78.3±5.4,与对照组三者表达率89.2±6.7,87.7±7.2和82.3±4.1相比无明显统计学差异(P>0.05);实验组DC细胞CD83,CD1a,CD86,CD80和HLADR表达的平均荧光指数(MFI)分别为4.80±2.13,3.96±1.15,12.33±6.75,19.63±8.12和39.44±7.9, 均低于对照组,但差异无统计学意义(P>0.05);口腔癌患者来源的DC在体外具有诱导同种异体和自体外周血T细胞增殖的能力. 结论: 口腔癌患者外周血单核细胞来源可诱导成为具有功能性的成熟DC,该细胞可应用于口腔癌的免疫治疗.
  0引言

  目前,对口腔癌的治疗手段仍以手术为主,由于颌面部能提供的切除面积有限,有时很难实现距肿瘤边缘1.5 cm清除病灶,而且手术本身造成的面部畸形严重破坏了患者的口腔功能和心理健康. 因此,如何缩小手术范围、有效控制临近亚病灶及微小病灶的发展是亟待解决的问题. 树突状细胞(dendritic cells, DC)是已知功能最强的抗原提呈细胞,并被认为是抗肿瘤免疫治疗的一种非常有前途的方法[1-3],由于DC对T细胞的活化受MHC限制,故临床应用的DC细胞及其疫苗必须使用肿瘤患者自身来源的DC,那么从肿瘤患者的外周血单个核细胞中能否经过体外诱导产生出功能性DC,口腔癌患者与健康人DC细胞的表型及其抗原提呈分子的表达以及刺激淋巴细胞增殖能力有何不同,因此本研究旨在为临床以DC为基础的免疫治疗提供实验依据.

  1材料和方法

  1.1材料RPMI培养基(Hyclone USA), 淋巴细胞分离液(上海恒生公司 ), 重组人单核巨噬细胞集落刺激因子(rhGMCSF),重组人白细胞介素4 (rhIL4), 肿瘤坏死因子α(TNFα)均使用美国Peprotech Asia公司产品. 取200505/200510来我院口腔科住院治疗的口腔癌患者15例作为实验组,本组病例均经术后病理证实;对照组为健康志愿者15例. 两组人员均排除感染、糖尿病、血液病和自身免疫性疾病.

  1.2方法无菌采集外周血50 mL,肝素钠抗凝. 加入等量无钙镁DHanks缓冲液(pH 7.4),充分混匀. 取50 mL离心管加入Ficoll淋巴细胞分离液20 mL后,再沿壁小心加入上述稀释的外周血20 mL,2000 r/min, 20 min离心,分离外周血单个核细胞. 小心吸取中间层细胞,用DHanks洗涤细胞3次,弃上清,用含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养液调整细胞浓度为1×1010个/L,接种于6孔培养板,每孔3 mL. 于50 mL/L CO2,37℃条件下孵育2~3 h后,吸出培养上清和非贴壁细胞(用于其他实验),用预热37℃的培养基清洗板1次,以去除非贴壁细胞,获得贴壁的单核细胞,加入含1 MU/L rhGMCSF和0.5 MU/L rhIL4的RPMI 1640完全培养基于37℃ 50 mL/L CO2进行培养,孵育至第5日时,每孔加入TNFα 0.2 MU/L, 7 d后得到成熟的DC[4]. 诱导培养1,3,5,7 d时用倒置显微镜观察细胞的形态变化及DC形成,在培养的7 d收集DC,调细胞密度为1×107/L,分为两份,一份用10 g/L戊二醛固定30 min,梯度乙醇脱水,叔丁醇干燥,喷金,扫描电镜观察细胞形态. 另一份用25 g/L戊二醛固定, 锇酸后固定, 醋酸钠、 柠檬酸铅双重染色, 透射电镜观察细胞超微结构.

  1.2.1FACS测定细胞表型收集体外培养5,7和10 d的外周血单个核细胞,台盼蓝染色,确定细胞活力在95%以上,分别加入直标荧光的,如PE标记的CD1a,CD86,HLADR,IgG1(对照),FITC标记的CD83,CD80,IgG2(对照),充分均匀染色(4℃, 避光, 30 min)后FACS行细胞表型检测.

  1.2.2混合淋巴细胞反应非贴壁细胞调整密度为2×109/L,加入96孔培养板中,分别按10∶1, 20∶1和40∶1的比例加入上述培养的两组DC(保持T细胞数为105),该DC先用25 mg/L丝裂霉素于37℃孵育45 min,然后调整细胞密度为2×108/L,加入培养板各孔内,总体积200 μL/孔,各实验组分设3复孔,混匀,同时设对照组. 37℃,50 mL/L CO2培养72 h. 于实验培养终止前4 h,加入MTT液(5 g/L) 20 μL/孔,混匀,继续培养4 h,离心培养板(1000 r/min, 5 min),弃上清,每孔加入DMSO(二甲基亚砜) 150 μL,充分混匀,静置数分钟,检测每孔490 nm的A值,计算细胞培养指数[5]. 增殖指数(SI)=试验孔A均值/对照孔A均值.

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