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放线菌素D和VM-26对大鼠胶质瘤细胞增殖的影响的

来源:天下论文    时间:2014-04-24 16:38  浏览次数:

  放线菌素D和VM-26对大鼠胶质瘤细胞增殖的影响的体内实验研究

  作者:武永康,董 伦,刘华伟,申林海

  【摘要】 目的 研究放线菌素D(Actinomycin D,ACTD)和替尼泊苷(Teniposide,VM-26)对大鼠胶质瘤细胞增殖的体内治疗效果。方法 将野生型的C6鼠胶质瘤细胞接种于鼠脑右侧尾状核(对照组10只,空载组10只),并对鼠脑内已形成的C6胶质瘤分别用ACTD及VM-26抗瘤缓释剂瘤区原位注射(治疗组各10只)。观察各组大鼠的一般情况、生存期、肿瘤病理学和磁共振成像(MRI)动态改变,采用PCNA计数、TUNEL法检测肿瘤细胞增殖活性及凋亡。结果 对照组及空载组大鼠平均生存期为19.3天,ACTD组6只及VM-26组3只大鼠生存期明显延长,存活期超过200天;除因病理检查人为处死各2只外,ACTD组治疗后4周内死亡2只,VM-26组5只。MRI检查对照组大鼠脑内有明显瘤灶,治疗组大鼠脑内瘤灶治疗后明显减少或消失,均与病理学检查结果一致,而且治疗组大鼠C6细胞增殖活性降低,大量细胞凋亡,ACTD较VM-26显著。结论 ACTD可望成为体内局部应用治疗胶质瘤的优选化疗药物。

  【关键词】 放线菌素D;替尼泊苷;神经胶质瘤;体内;化疗

  我们以往的研究结果表明,放线菌素D(Actinomycin D,ACTD)可显著抑制C6鼠胶质瘤细胞恶性增殖诱导细胞凋亡,在4个不同的浓度对比中ACTD的抑瘤作用均强于替尼泊苷 (Teniposide,VM-26),凋亡率在大剂量ACTD时的作用明显优于VM-26[1]。为进一步明确二者对恶性胶质瘤化疗疗效,我们研究了 C6细胞接种于鼠脑的致瘤性以及对鼠脑内已形成瘤灶的C6胶质瘤应用ACTD及VM-26的抗瘤缓释剂瘤区原位治疗的疗效,观察大鼠的一般情况、生存期、肿瘤体积变化以及肿瘤病理组织学与细胞生物学特征变化。

  1 材料与方法

  1.1 实验材料 C6鼠胶质瘤细胞系由中国科学院动物所提供。细胞培养基:DMEM (Dulbecco modified eagle medium Gibco,USA),小牛血清(Hyclone,USA)。主要生化试剂:将消毒后的医用明胶10g加入注射用水50ml,分别加入ACTD 0.1g及VM-26 0.5mg,搅拌成半流状,制成抗瘤缓释剂。原位细胞凋亡检测试剂盒(Roche,Germany),ABC免疫组化试剂盒及抗体(北京中山及其代理的 Santa Cruz公司)。主要仪器:江湾Ⅰ型脑立体定向仪(第二军医大学生产),磁共振仪(Advantage 1.5 Tesla GE Medical Systems,GE Corporation,USA)。实验动物:二级雄性SD大鼠,体重200~300g,共40只,由北京生物制品检定所繁育场提供,其特征已经鉴定。

  1.2 实验方法

  1.2.1 C6鼠脑胶质瘤模型的建立 C6鼠胶质瘤细胞于含10%小牛血清的DMEM培养液中单层培养。接种细胞量为1.0×106/(10μl·只)。大鼠经10%水合氯醛(300mg /kg)腹腔注射麻醉后,固定于江湾Ⅰ型脑立体定向仪上,手术暴露颅骨标志,在前囟位置,矢状缝右侧3.0~3.5mm处用牙钻钻孔,孔径1.2mm,用微量注射器垂直穿刺右尾状核,将细胞悬液缓慢注入。

  1.2.2 实验动物分组及组织标本采集 颅内实验运动分为4组,每组各10只SD大鼠:(1)对照组:接种野生型C6鼠胶质瘤细胞;(2)空载缓释剂组:接种野生型C6鼠胶质瘤细胞后瘤体多点注射半流状医用明胶;(3)ACTD治疗组:治疗组C6鼠胶质瘤细胞种植后第5天,MRI证实有肿瘤形成时,分别于第6、28天按上述方法麻醉、固定动物;同时将制备好的ACTD抗瘤缓释剂原位多点注入瘤体;(4)VM-26治疗组:治疗组C6鼠胶质瘤细胞种植后第5天,MRI证实有肿瘤形成时,分别于第6 天按上述方法麻醉、固定动物;同时将制备好的VM-26抗瘤缓释剂载体原位多点注射入瘤体。接种后28、58天各处死1只,瘤标本做常规HE染色并检测凋亡;其余8只长期观察生存期。

  各组实验动物在其自然死亡或人为处死后取出脑组织,将肿瘤标本于10%福尔马林溶液中固定,常规石蜡包埋后冠状切片,行大体标本观察、常规HE染色;另进行PCNA免疫组化染色。另一部分标本用OCT包埋液氮速冻-70℃保存冰冻切片,行原位细胞凋亡的检测。

  1.2.3 MRI成像及检测方法[2] 用GE公司1.5T Signa MR机成像,冠状面和矢状面T1WI平扫及增强扫描。根据动物模型对照组生存期规律,本实验的治疗组和空载组各10只大鼠于种植后5天进行全部检测,了解成瘤情况,以便治疗。大鼠种植后1周随机选择4只动物进行检测。以后连续检测各组大鼠的肿瘤生长变化,具体时间为2周、4周、8周、12周。每次检测,除至少选择3只种植后5天或1周已进行检测的动物连续监测外,其他动物则每次选择1~2只轮换进行检测,了解动物成瘤率。

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