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碳离子辐射对人肝癌细胞SMMC-7721 细胞周期和P53、

来源:万方数据库    时间:2013-07-23 14:14  浏览次数:

  碳离子辐射对人肝癌细胞SMMC-7721 细胞周期和P53、MDM2 及P21 表达的影响

  作者:王燕玲 张 红 段昕 刘兵 周清明 李小达 郝冀芳 刘辉 赵卫平

  摘要 研究12C6+离子辐照对体外培养人肝癌细胞SMMC-7721 细胞周期和P53、MDM2 及P21 表达的影响。采用0、1.0、2.0、4.0、6.0Gy 12C6+离子束辐照细胞,用克隆形成法观察细胞存活情况;同时在辐照24h 后用流式细胞仪检测细胞周期的变化,Western-blot 检测细胞中P53、MDM2 及P21 蛋白表达情况。结果发现,重离子辐照后细胞存活率显著下降;1.0Gy、4.0Gy 和6.0Gy 照射组发生G0/G1 期阻滞,而2.0Gy 照射组出现G2/M期阻滞;Western-blot 结果显示细胞辐照后MDM2 的57kD 蛋白表达水平无明显变化,而76kD 蛋白表达水平随辐照剂量逐渐上升;P53 和P21 蛋白表达水平随辐照剂量增高。以上结果提示不同剂量的12C6+离子束照射可激活SMMC-7721 细胞不同的细胞周期检测点,其中G0/G1 期阻滞与P53 和P21 蛋白以及MDM2 截短体76kD蛋白的表达水平升高有关。

  关键词 碳离子辐射,人肝癌细胞,细胞周期,P53,MDM2,P21

  中图分类号 Q274, Q691, R730.2, R735.7

  重离子是一种致密的电离辐射,具有高线性传能密度(Linear energy transfer, LET)、能量沉积密集、局部剂量大、相对生物学效应高等特点,在各学科领域展现出极大的应用前景,如重离子治癌是肿瘤定位放疗的发展趋势,其相关的生物学研究已成为当今放射生物学、放射医学、放射治疗学与重离子物理交叉学科研究的热点和前沿课题。近年来,重离子辐射生物效应研究主要涉及DNA 损伤和修复、染色体畸变、细胞周期效应、致瘤性转化和基因组的不稳定性等。

  一般认为电离辐射可使细胞发生G1 期、S 期和G2 期阻滞,其中G1 期阻滞的发生依赖于野生型p53基因(wtp53)的调节。p53 通过调节其下游效应基因(如mdm2、p21)的转录而实现其调节辐射所致的G1 期阻滞功能[3]。鼠双微体(Mouse double minute 2 , MDM2)是细胞内调节P53 浓度及活性的重要蛋白质,两者构成似电流环路中的负反馈,彼此相互进行精细的调节。在辐射引起脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid, DNA 损伤的过程中,p53

  在接受损伤信号后被激活,高水平的wtp53 诱导mdm2 基因转录,MDM2 蛋白反过来与P53 蛋白结合并导致P53 蛋白降解,接着引起mdm2 基因发生下调。如此,MDM2 与P53 之间形成自我反馈环,限制了G1 期阻滞的时间,使DNA 损伤修复后的细胞再进入细胞周期。P21 是另一P53 的下游激活产物,当细胞DNA 损伤后,P53 蛋白积聚,使p21基因表达上调,抑制G1→S 过渡中周期素E /蛋白激酶2(cyclin E-CDK2)复合物的形成,抑制了G1→S过渡。因而,P21 在辐射诱导G1 期阻滞的发生中起重要作用。本文观察了12C6+离子辐射对体外培养的人肝癌细胞SMMC -7721 细胞周期的影响,同时检测了照射前后细胞中P53、MDM2 及P21 蛋白表达

  情况,以探讨重离子辐射产生的细胞周期效应并分析其产生机制。

  1 材料与方法

  1.1 实验材料及照射条件

  人肝癌细胞SMMC-7721 为本室保存,培养于含10%胎牛血清(兰州民海生物工程有限公司)RPMI-1640 (GIBCO)培养液中。实验中所用一抗为兔抗人P53、MDM2 和P21 抗体(Santa Cruz

  Biotechnology),二抗为碱性磷酸酶耦联的羊抗兔IgG(Invitrogen)。Bradford 蛋白含量检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。

  取对数生长期的SMMC-7721 细胞接种到直径35mm 的培养皿中(1x105个/皿),作5% CO2、37℃培养过夜。重离子照射在兰州重离子研究装置(HIRFL)辐照终端进行,12C6+离子束能量为831.28MeV,LET 为35.5 keV/μm,吸收剂量率2Gy/min,细胞吸收剂量分别是0、1.0、2.0、4.0、6.0Gy。用空气电离室监测剂量,样品更换和剂量的数据获取由计算机控制。样品照射在室温下进行。

  1.2 克隆形成法测定细胞存活率

  样品照射后,用胰酶将贴壁细胞消化下来,取少量细胞悬液计数并将样品稀释至适当浓度。按不同剂量、不同重复组计算预置细胞数,按预置数(200—50000 个/皿)将一定量的细胞悬液接种到Φ60mm培养皿中,每个剂量点3 皿重复。于饱和湿度5%CO2、37℃条件下培养8d,卡诺液固定, Giemsa染色,统计多于50 个细胞的集落数。绘制存活曲线。

  1.3 流式细胞术检测受照后细胞周期变化

  照射后24h 用胰酶消化收集细胞悬液,离心弃上清,用pH 7.2 的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2 次;弃上清,将沉淀悬起,加入70%的乙醇振荡混匀,-20℃固定30min;离心弃上清,将沉淀悬起,用PBS洗涤2 次;离心弃上清,重悬后加入100μL 的PI染料,振荡混匀后室温避光染色30min;离心弃上清,将沉淀悬起,用PBS 洗涤2 次,加入1mL PBS制成细胞悬液,用FACSCalibur 流式细胞分析仪(Becton Dickinson)分析。

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