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重组小鼠血管抑素基因转染抗血管生成治疗胆囊

来源:论文天下    时间:2013-09-10 13:52  浏览次数:

  重组小鼠血管抑素基因转染抗血管生成治疗胆囊癌的实验研究

  作者:张吉成,陈燕凌,张德新,陈宏明,杨定忠,王作仁

  【摘要】 目的:研究重组小鼠血管抑素基因真核表达质粒转染的胆囊癌细胞表达具有抑制血管内皮细胞生长活性的血管抑素蛋白,以及对裸鼠种植性胆囊癌生长的抑制作用. 方法:应用脂质体lipofectamine2000将重组小鼠血管抑素基因的真核表达质粒pcDNA3.1(+)angiostatin转染胆囊癌细胞株GBCSD,G418抗性筛选;以Western blot检测血管抑素的表达,以血管内皮细胞增殖分析检测其生物学活性,接种裸鼠并比较肿瘤体积和肿瘤微血管密度(MVD). 结果:得到表达血管抑素的胆囊癌细胞克隆,其培养上清能有效抑制bFGF刺激的血管内皮细胞增殖(P<0.01);血管抑素组裸鼠肿瘤体积小于野生细胞对照组(P<0.01),免疫组化检测显示血管抑素组裸鼠肿瘤微血管密度(MVD)低于野生细胞对照组(P<0.05). 结论:血管抑素基因转染对裸鼠种植性胆囊癌的生长有抑制作用,这是血管抑素组肿瘤组织内新生血管形成受到抑制而减少所致.

  【关键词】 胆囊肿瘤;血管抑素;抗血管生成;基因转染

  0引言

  胆囊癌预后极差,故积极探索胆囊癌的基因治疗具有非常重要的意义.肿瘤的生长依赖于丰富的血供,通过抑制肿瘤新生血管形成就可以使肿瘤缺血坏死达到治疗目的.血管抑素(angiostatin)是1994年OReilly等[1]发现的能强烈抑制血管内皮细胞生长和新生血管形成的蛋白质.为此,我们拟应用重组小鼠血管抑素基因的真核表达质粒转染胆囊癌细胞株, 检测血管抑素的蛋白表达,并观察其对血管内皮细胞的作用和对裸鼠种植性胆囊癌生长的影响.探索血管抑素在胆囊癌血管抑制基因治疗中的意义.

  1材料和方法

  1.1材料E. coli DH5α菌和pcDNA3.1(+)由陕西省人民医院病毒室保存. 血管抑素angiostatin cDNA基因片断和兔抗HAtag多克隆抗体由第四军医大学西京医院张德新博士惠赠.基因测序:上海申友生物技术公司.脂质体lipofectamine2000,G418和DMEM培养基:Gibco公司.λdsDNA/HindⅢ标准物和各种限制性核酸内切酶:华美公司或New England Biolabs公司.质粒提取和胶回收试剂盒:上海华舜公司.Balb/c裸鼠:第四军医大学实验动物中心,SPF条件下饲养.胆囊癌细胞株GBCSD:中科院上海细胞生物学研究所,在含150 mL/L小牛血清、高糖DMEM培养液中,37℃,50 mL/L CO2条件下培养.血管内皮细胞系ECV304:第四军医大学口腔医院,在含100 mL/L胎牛血清、高糖DMEM培养液中,37℃, 50 mL/L CO2条件下培养.

  1.2方法

  1.2.1pcDNA3.1(+)angiostatin质粒构建和基因转染经酶切、 回收和连接将血管抑素angiostatin cDNA基因片断装入真核表达载体pcDNA3.1(+),转化、挑选抗性克隆和提纯质粒,经酶切鉴定和基因测序证实.连续培养胆囊癌细胞株GBCSD,脂质体lipofectamine2000基因转染,设置实验组(血管抑素组)pcDNA3.1(+)angiostatin 1.2 μg/脂质体3 μL,阴性对照组(空载体对照组)pcDNA3.1(+) 1.2 μg/脂质体3 μL,空白对照组脂质体3 μL.转染48 h后换用含筛选浓度新霉素G418 (400 mg/L)的选择培养液培养.1 wk后空白对照组细胞全部死亡,实验组和阴性对照组4 wk后均出现肉眼可见的细胞克隆,随机挑选抗性克隆,待细胞扩增后移至培养瓶用200 mg/L G418培养液扩大培养.另取野生GBCSD细胞为对照,同时测定该3组肿瘤细胞的体外生长曲线:用不含G418的150 mL/L小牛血清、高糖DMEM培养液培养,取对数生长期的细胞1×104接种于24孔培养板中,每日计数3孔中的细胞数绘制生长曲线.

  1.2.2血管抑素的表达及生物学活性用Western blot法检测血管抑素的表达,无血清培养液培养细胞5 d,收集培养上清,用lysinesepharose纯化;120 g/L丙烯酰胺凝胶变性蛋白电泳SDSPAGE;用硝酸纤维素膜300 V恒压电转移2 h;按Western blot kit说明书操作:蛋白封闭液封闭膜30 min,一抗为兔抗HAtag多克隆抗体(1∶150),孵育40℃过夜;二抗为辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG(1∶400),室温孵育1 h,DAB显色.用血管内皮细胞增殖分析法检测血管抑素的生物学活性:取对数生长期的ECV304细胞,用2.5 g/L胰蛋白酶,2 g/L EDTA消化后,用培养液(含100 mL/L FBS的DMEM)调细胞密度为1.0×108/L,接种于24孔板,每孔接种0.5 mL,于37℃,50 mL/L CO2条件下培养24 h,换用含1 μg/L bFGF的新鲜培养液,并加入含血管抑素的培养液上清继续培养24 h,进行MTT比色法检测,于570 nm处测其A值.对照组为空白载体转染的GBCSD胆囊癌细胞的培养液上清.

  1.2.3裸鼠肿瘤生长体积测定将Balb/c裸鼠(鼠龄4~6 wk)11只随机分成2组,在裸鼠背部皮下注射1×1010/L对数生长期细胞悬液0.2 mL,血管抑素组6只,野生GBCSD细胞对照组5只,分别注射GBCSD/pcDNA3.1(+)angiostatin细胞和GBCSD细胞;观察30 d后处死荷瘤裸鼠,切取肿瘤并测量其长径a和短径b(单位mm),按公式1/2×ab2计算肿瘤的体积.

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